HPV Quantitative Real-time PCR

Ο καρκίνος του τραχήλου της μήτρας είναι μια από τις κύριες κακοήθεις ασθένειες του αναπαραγωγικού συστήματος. Κάθε δεκαοκτώ λεπτά μια γυναίκα στην Ευρώπη χάνει τη ζωή της εξαιτίας του συγκεκριμένου τύπου καρκίνου, ενώ στην Κύπρο έχουμε κάθε χρόνο 30 θανάτους από την αιτία αυτή.

Ο κυριότερος παράγοντας πρόκλησης του τύπου αυτού καρκίνου, είναι ο ιός των ανθρώπινων θηλωμάτων (HPV, Human Papiloma Virus) και ο κύριος τρόπος μετάδοσης του είναι μέσω της σεξουαλικής επαφής. Ο ιός αυτός έχει κυκλική μορφή και αποτελείται από το πρωτεïνικό περίβλημα (κάψα) μέσω του οποίου προσκολλάται στα κύτταρα ώστε το γενετικό του υλικό ( DNA) να εισέλθει σε αυτά. Το DNA του HPV ενσωματώνεται μέσα στο γονιδίωμα των κυττάρων του τραχήλου της μήτρας και προάγει την ενεργοποίηση των ογκογονιδίων ενώ καταστέλλει την ανοσιοβιολογική απόκριση κατά του ιού, από τα Τ-κυτταροτοξικά λεμφοκύτταρα του ξενιστή. Ταυτόχρονα πρωτείνες του HPV αναστέλλουν τα επιδιορθωτικά ένζυμα κατά την αντιγραφή του DNA σε διαιρούμενα κύτταρα με αποτέλεσμα την δημιουργία μεταλλάξεων και τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό τους.

Μια τέτοια λοίμωξη, αν δεν ανιχνευθεί άμεσα οδηγεί σε καρκινογένεση. Μέχρι σήμερα έχουν προσδιοριστεί περίπου 198 διαφορετικοί τύποι στελεχών του HPV. Το ποσοστό ανίχνευσης του γενετικού υλικού του ιού σε βιοψίες ασθενών φτάνει το 99,5%. Περίπου 40 στελέχη έχουν εντοπιστεί στα επιθήλια ή τo δέρμα της πρωκτoγεννητικής περιοχής σε άνδρες και γυναίκες. Τα άλλα στελέχη προσβάλλουν συνήθως τo δέρμα σε άλλες περιοχές του σώματος, τα επιθήλια της στoματικής κoιλότητας, του ανώτερoυ αναπνευστικού και σπάνια άλλους ιστούς.

Ανάλογα με την ικανότητα του στελέχους να προκαλέσει καρκινογένεση στο επιθήλιο, τα στελέχη χωρίζονται σε δύο τύπους, υψηλού και χαμηλού κινδύνου. Οι τύποι HPV 16, 18, 31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68, 73, 82 ανήκουν στους τύπους υψηλού κινδύνου ογκογένεσης και ευθύνονται για την δημιουργία προκαρκινικών και καρκινικών αλλοιώσεων που οδηγούν στην ανάπτυξη καρκίνου σε διάστημα 5-15 χρόνων και σε πιο σπάνιες περιπτώσεις σε 1-2 χρόνια. Ειδικότερα ο τύπος 16 ανιχνεύται στο 50% περιπτώσεων καρκίνου του τραχήλου στην Ευρώπη. Τα στελέχη 6, 11, 36, 42, 43, 44, 46, 47, 50 ανήκουν στους τύπους χαμηλού ογκογονικού κινδύνου. Μπορούν να προκαλέσουν τα γνωστά κονδυλώματα (ακροχορδόνες των γεννητικών οργάνων) που ανήκουν στις καλοήθεις αλλοιώσεις.

Ο μοριακός έλεγχος για τον HPV παρέχει μια ολοκληρωμένη εικόνα για την ύπαρξη κινδύνου για την ανάπτυξη καρκίνου τραχήλου της μήτρας, βοηθώντας στη σωστή πρόληψη και λειτουργεί ως ένα τεστ αναφοράς για πιθανή καρκινογένεση. Οι πρόσφατες κατευθυντήριες γραμμές προτείνουν οι μοριακές εξετάσεις για HPV να γίνονται σε γυναίκες μεγαλύτερες των 30 ετών ή σε νεότερες γυναίκες με υψηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακές αλλοιώσεις. Το τέστ αυτό δεν υποκαθιστά σε καμιά περίπτωση το τέστ ΠΑΠ όμως αν στην συγκεκριμένη εξέταση βρεθουν ¨άτυπα επιθηλιακά κύτταρα απροσδιόριστης σημασίας¨ ή ¨χαμηλού βαθμού ενδοεπιθηλιακή βλάβη¨ τότε ο μοριακός έλεγχος θεωρείται επιβεβλημένος.

Η εξέταση μπορεί να πραγματοποιηθεί σε τραχηλικό επίχρισμα, σε ουρηθρικό επίχρισμα, και σε δείγμα σπέρματος. Η μέθοδος της Real-time PCR χρησιμοποείται για την ανίχνευση του γενετικού υλικού του ιού ενώ ταυτόχρονα προσδιορίζει ποσοτικά το ιικό φορτίο που υπάρχει στα κύτταρα. Η μέθοδος ξεκινά με την εκχύλιση νουκλεϊκών οξέων από το δείγμα που πραγματοποείται αυτοματοποιημένα στους τέσσερις extractors προηγμένης τεχνολογίας που διαθέτει το εργαστήριο ελαχιστοποιώντας τον παράγοντα του ανθρώπινου λάθους και μεγιστοποιώντας την ευαισθησία της μεθόδου.Στη συνέχεια, ακολουθεί η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης που γίνεται από εξειδικευμένους μοριακούς βιολόγους του εργαστηρίου χρησιμοποιώντας πολλαπλασιαστές κορυφαίων εταιρειών σε μοριακές εφαρμογές, όπως της εταιρείας QIAGEN και DNA technology.

Η μέθοδος αυτή βασίζεται στην μέτρηση του φθορισμού σε κάθε κύκλο πολλαπλασιασμού. Η μέθοδος χρησιμοποιεί τον Taqmanprobe ο οποίος όταν υβριδοποιηθεί σε μια αλληλουχία στόχο υδρολύεται από την Taq-πολυμεράση με αποτέλεσμα ο ανιχνευτής και ο αποσβέστης του φθορισμού να διαχωρίζονται και το σήμα του φθορισμού να αυξάνεται ανάλογα με τον πολλαπλασιαμό της αλληλουχίας στόχου του στελέχους του HPV. Τα φθοροφόρα FAM, ROX και Cy5 χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση ειδικών αλληλουχίων στα στελέχη του HPV ενώ το φθοροφόρο HEX χρησιμοποιείται για την ανίχνευση του internal control. Το Internal Process Control (IPC), το οποίο προστίθεται κατά τη διάρκεια της εκχύλισης DNA, ανιχνεύεται στην ίδια αντίδραση με έναν σημασμένο ανιχνευτή και επιτρέπει την ανίχνευση αναστολής της RT-PCR από διάφορους παράγοντες. Δρα επίσης ως έλεγχος εξασφαλίζοντας ότι το ιϊκό DNA απομονώθηκε από το βιολογικό δείγμα, αποτρέποντας έτσι τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα λόγω ανεπαρκούς ποσότητας γενετικού υλικού ή ακατάλληλης μεταφοράς του δείγματος. Το πλεονέκτημα του συγκεκριμένου τύπου PCR είναι ότι με την χρήση διάφορων φθοροφόρων ανιχνεύει ταυτόχρονα σε μια μόνο αντίδραση τα στελέχη χαμηλού και υψηλού ογκογονικού κινδύνου του HPV. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων γίνεται από το εξειδικευμένο και έμπειρο προσωπικό αυξάνοντας έτσι την αξιοπιστία των αποτελεσμάτων που δίνονται στους υποψηφίους προς εξέταση. Η ποσοτικοποιήση του HPV DNA στο δείγμα γίνεται μέσω της απόλυτης ανάλυσης που περιλαμβάνει τον ακριβή υπολογισμό του ιϊκού φορτίου στο δείγμα και λαμβάνοντας υπόψην την κλινικά σημαντική συγκέντρωση του ιού ώστε να αναπτυχθεί νεοπλασία στον τράχηλο δίνοντας μια ολοκληρωμένη εικόνα στον γιατρό για την θεραπεία που πρέπει να ακολουθήσει.

Η συγκεκριμένη μέθοδος λόγω της υψηλής ευαισθησίας της, και τον ταυτόχρονο διαχωρισμό μεταξύ στελεχών χαμηλού και υψηλού ογκογονικού κινδύνου περιορίζει τον αριθμό των παθολογικών περιστατικών που διαφεύγει της ανίχνευσης με την εκτέλεση της κυτταρολογικής μεθόδου (τεστ ΠΑΠ) και αυξάνει το ποσοστό των αληθώς αρνητικών αποτελεσμάτων (δηλαδή αυτών που δεν παρουσιάζουν κακοήθεια). Παράλληλα η χρήση της προηγμένης τεχνολογίας καθώς και η πλήρης εκπαίδευση και κατάρτιση των μοριακών βιολόγων του ΧΗΜΕΙΟΥ Α. ΕΥΑΓΓΕΛΟΥ είναι σε θέση να παρέχουν στον πληθυσμό της Κύπρου σε αποκλειστικότητα, το καινοτόμο και αξιόπιστο αυτό τεστ, συμβάλλοντας σημαντικά στην μάχη κατά του καρκίνου του τραχήλου της μήτρας, ελέγχοντας και τους 21 υποτύπους του ιού HPV, τόσο αυτών με υψηλό κίνδυνο ογκογονικότητας όσο και αυτών με χαμηλό κίνδυνο ογκογονικότητας.